Interzelluläre Kommunikation in Bakterien

Einleitung

Innerhalb des letzten Jahrzehnts wurde das Konzept, dass Bakterienzellen autonome Individuen darstellen, die ihrem eigenen Programm folgen und nicht miteinander kommunizieren, ersetzt durch eine realistischere Einschätzung, nach der Bakterienzellen mittels interzellulärer Signalmoleküle ausgiebig miteinander kommunizieren, sowohl innerhalb einer Art als auch zwischen verschiedenen Arten [11]. In der Tat wurde jetzt erkannt, dass eine Vielzahl typisch bakterieller Prozesse, wie die Infektion von Menschen, Tieren und Pflanzen oder die Stimulation des Pflanzenwachstums entscheidend von der Kommunikationsfähigkeit der Bakterien abhängen.

Wie andere Kommunikationssysteme sind die von Bakerienzellen genutzten Systeme aus vier Komponenten aufgebaut: Signalausgabe, Art des Signals, Empfang eines Signals und Ausgabe einer Signalantwort. Um zu verstehen, wie Bakterien miteinander kommunizieren, muss jede dieser vier Komponenten auf molekularer Ebene analysiert werden. Meine Arbeitsgruppe untersucht diese Fragen an dem einzigartigen interzellulären Signalsystem von Myxococcus xanthus. Das Signal in diesem System, das so genannte C-Signal, hilft den Bakterien, multizelluläre Fruchtkörper als Reaktion auf einen Nährstoffmangel zu bilden.

Myxobakterien gelten als Paradebeispiel für interzelluläre Kommunikation in Bakterien. Sie leben in den oberen Bodenschichten, wo sie sich von organischem Material und von anderen Mikroorganismen ernähren, indem sie hydrolytische Enzyme, Antibiotika und cytotoxische Verbindungen ausscheiden [7]. Innerhalb der Myxobakterien ist Myxococcus xanthus am besten untersucht. Genetische Werkzeuge ermöglichen es, das soziale Verhalten dieses Bakteriums auf molekularer Ebene zu untersuchen. Darüber hinaus wurde die Sequenzierung des M. xanthus-Genoms vor kurzem abgeschlossen, was die detaillierte Durchführung funktioneller Genomanalysen erlaubt. M. xanthus bildet zwei morphologisch verschiedene Arten von Biofilmen, je nach Nährstoffversorgung der Zellen ([9] Abb. 1). Wenn ausreichende Mengen an Nährstoffen vorhanden sind, wachsen die stäbchenförmigen Bakterien als Einzelzellen. Auf festen Oberflächen bilden die beweglichen Bakterien sich gemeinschaftlich ausbreitende und sich gemeinschaftlich ernährende Kolonien. Als Reaktion auf einen Nährstoffmangel wird das Entwicklungsprogramm, das in der Bildung der prächtigen, multizellulären, mit Sporen gefüllten Fruchtkörper gipfelt, initiiert.

Die ersten Zeichen der Fruchtkörperbildung werden etwa 4-6 Stunden nach Beginn des Hungerzustands sichtbar, wenn die Zellen zu aggregieren beginnen und erste kleine Aggregationszentren entstehen. Die Aggregationszentren vergrößern sich durch das Eintreten weiterer Zellen und es entstehen schließlich symmetrische Hügel. Nach etwa 24 Stunden ist der Aggregationsprozess abgeschlossen und die entstehenden Fruchtkörper enthalten etwa 10⁵ dicht gepackte Zellen. Innerhalb der entstehenden Fruchtkörper differenzieren die stäbchenförmigen Zellen zu Sporen, was zur Bildung des reifen Fruchtkörpers führt (Abb. 1). Obwohl jede Zelle, die dem Hungerzustand ausgesetzt ist, das Potenzial besitzt, sich zu einer Spore zu entwickeln, differenzieren interessanterweise nur Zellen im Inneren der Fruchtkörper zu Sporen. Zellen außerhalb der Fruchtkörper bleiben stäbchenförmig oder lysieren. Die Sporen sind gegenüber Nährstoffmangel und einer Reihe chemischer und physikalischer Stressfaktoren resistent. Dies hilft, das Überleben der Zellen unter widrigen Bedingungen sicherzustellen.

In Gegenwart von Nährstoffen keimen die Sporen in den Fruchtkörpern zu metabolisch aktiven Zellen aus. Mit jedem Fruchtkörper, der etwa 10⁵ Sporen enthält, führt die Auskeimung mit einem Schlag zu einer neuen, sich ausbreitenden und gemeinschaftlich ernährenden Kolonie. Somit sind Fruchtkörper ideal geeignet, um sicherzustellen, dass der neue vegetative Zyklus mit einer großen Zellgemeinschaft und nicht mit einer Einzelzelle beginnt.

Interzelluläre Signalübertragung während der Fruchtkörperbildung in Myxococcus xanthus

Die Fruchtkörperbildung ist entscheidend vom Austausch interzellulärer Signale abhängig [8] (Abb. 1). Die Rolle dieser Signale ist es, die Aktivitäten der Zellen während der Fruchtkörperbildung zu koordinieren und zu synchronisieren. Bislang wurden zwei dieser interzellulären Signale, das A- und das C-Signal, biochemisch und funktionell untersucht. Das A-Signal wird für die Fruchtkörperbildung wichtig, nachdem sich die Zellen etwa 2 Stunden im Hungerzustand befunden haben (Abb. 1). Es ist Teil eines Systems, das die Zelldichte in hungernden Zellen misst. Das A-Signalsystem garantiert somit, dass die Fruchtkörperbildung nicht initiiert wird, bevor nicht eine genügend große Zahl an Zellen hungert. Das C-Signal tritt nach etwa 6 Stunden im Hungerzustand in Aktion und koordiniert den Prozess der Fruchtkörperbildung.

Das C-Signal

Das C-Signal wird während der Fruchtkörperbildung wiederholt genutzt und koordiniert drei verschiedene Prozesse: Anfangs induziert das C-Signal die Aggregation von Zellen zu den Fruchtkörpervorläufern. In der späten Phase der Fruchtkörperbildung induziert das C-Signal die Sporulation von Zellen, die sich im Inneren der Fruchtkörper angehäuft haben. Gleichzeitig induziert das C-Signal die Expression einer Vielzahl von Entwicklungsgenen. Um zu verstehen, wie ein Signal drei verschiedene Prozesse koordiniert, die zeitlich und räumlich von einander getrennt sind, haben wir uns zunächst auf die Aufklärung des C-Signal-Transduktionswegs konzentriert (Abb. 2).

C-Signal-Synthese

Die Synthese des C-Signalmoleküls ist vom csgA-Gen abhängig. Das CsgA-Protein existiert in zwei Formen, einer 25 kDa Form (als p25 bezeichnet), das dem Produkt des csgA-Gens entspricht, und einer 17 kDa Form (als p17 bezeichnet) [3]. p17 entspricht den C-terminalen Aminosäuren von p25 [6]. Durch partielle Reinigung des C-Signals konnten Lobedanz und Søgaard-Andersen zeigen, dass das C-Signal zusammen mit p17 gereinigt wird und dass p17 in der äußeren Membran lokalisiert ist [6]. Übereinstimmend hiermit konnte gezeigt werden, dass rekombinantes p17 C-Signal-Aktivität besitzt [6]. Diese Daten deuten stark darauf hin, dass p17 das eigentliche C-Signal darstellt. Das 17 kDa C-Signal wird in einem proteolytischen Schritt durch eine spezifische Serin-Protease aus p25 generiert. Diese Protease wird während des Entwicklungszyklus verstärkt gebildet [6].

Der C-Signal-Transduktionsweg

Die Übertragung des C-Signals zwischen den Zellen hängt vom direkten Kontakt einer Donor- und einer Empfängerzelle ab [9]. In dem Modell zum C-Signal-Transduktionsweg stellt daher die Interaktion zwischen dem p17 C-Signal-Protein auf der Oberfläche einer Zelle mit einem C-Signal-Rezeptor auf einer benachbarten Zelle die eigentliche Signalübertragung dar (Abb. 2). Dieser Rezeptor wurde bislang jedoch noch nicht identifiziert. Die erste identifizierte Komponente des Signaltransduktionswegs ist das DNA-bindende Response Regulatorprotein FruA. FruA besteht aus einer N-terminalen Empfängerdomäne und einer C-terminalen DNA-Bindedomäne [9]. Die Aktivität von FruA wird auf zwei Ebenen reguliert. Auf der ersten Ebene induziert das früh im Entwicklungszyklus wirkende A-Signal die Transkription von fruA. Auf der zweiten Ebene wird das FruA-Protein durch das C-Signal aktiviert, vermutlich, indem es die Phosphorylierung von FruA induziert. Hierbei entsteht eine aktive Form von FruA, welche nachfolgende Schritte im Signaltransduktionsweg reguliert. Die Histidin-Protein-Kinase, die FruA phosphoryliert, wurde bislang nicht identifiziert.

Phosphoryliertes FruA stellt einen Verzweigungspunkt im C-Signaltransduktionsweg dar (Abb. 2). Ein Zweig führt zur Aggregation. Die Proteine des Frz-Chemosensorsystems spielen hierbei eine wichtige Rolle. Die Frz-Proteine stellen ein cytoplasmatisches Signaltransduktionssystem dar, das das Bewegungsmuster der Zellen kontrolliert [10]. Auf molekularer Ebene fungiert das C-Signal als Eingangssignal für das Frz-System und induziert die Methylierung des FrzCD-Proteins, einem Chemotaxisprotein. Die durch das C-Signal induzierte Methylierung von FrzCD ist von FruA und der Methyltransferase FrzF abhängig. Auf zellulärer Ebene führt die C-signalabhängige Veränderung der Aktivität des Frz-Systems zu einer Änderung im Verhalten der Zellen, was zur Aggregation führt [1].

Der zweite, phosphoryliertem FruA nachgeschaltete Zweig führt zur C-signalabhängigen Genexpression und zur Sporulation (Abb. 2). C-Signal und FruA regulieren gemeinschaftlich etwa 50 Gene einschließlich des devTRS-Operons. Die DevTRS-Proteine wiederum werden für die Expression eines Sporulationsgens benötigt, das die Tn5lac Ω7536 Insertion trägt.

Ein dritter Zweig im C-Signaltransduktionsweg wirkt vorgeschaltet zu FruA und führt zur C-signalabhängigen Verstärkung der Expression des csgA-Gens (Abb. 2). Insgesamt verstärkt sich die Expression von csgA als Reaktion auf einen Hungerzustand etwa vierfach. Diese verstärkte Expression hängt von zwei Eingangssignalen ab: Von der RelA-abhängigen, durch Nährstoffmangel induzierten stringenten Kontrolle und vom C-Signal selbst. Die C-signalabhängige Verstärkung der csgA-Transkription hängt vermutlich von vier Proteinen ab, die durch das act-Operon kodiert werden [9]. csgA-Transkription führt zur Akkumulation von p25, das exportiert und zum 17 kDa C-Signal-Protein prozessiert wird. P17 wird in der äußeren Membran verankert. Das Protein ist somit auf der Zelloberfläche exponiert und kann mit dem C-Signal-Rezeptor einer benachbarten Zelle interagieren.

Der C-Signaltransduktionsweg ist nur im Hungerzustand aktiv; er wird über die Induktion der stringenten Kontrolle in Gang gesetzt. Diese wiederum induziert die csgA-Transkription und die Akkumulation des A-Signals (Abb. 2).

Wie induziert ein Signal drei verschiedene, zeitlich und räumlich getrennte Reaktionen?

Ein Charakteristikum der Fruchtkörperbildung ist die zeitlich und räumlich getrennte Koordination von Aggregation und Sporulation: Die Aggregation geht der Sporulation voraus und die Zellen beginnen erst mit der Sporulation, wenn der Aggregationsprozess abgeschlossen ist und die Zellen sich innerhalb der Fruchtkörper in hoher Dichte angereichert haben. Da das C-Signal sowohl die Aggregation als auch die Sporulation kontrolliert, stellt sich die Frage, wie dieses Signal beide Prozesse zeitlich und räumlich koordiniert.

Bei näherer Betrachtung des C-Signaltransduktionswegs wird klar, dass dieser Weg über zwei Regelkreise verfügt, die zur Signalverstärkung führen. In dem ersten Regelkreis induziert die C-Signalübertragung die Zellaggregation, was zu einer höheren Zelldichte führt. Da die Übertragung des C-Signals einen direkten Kontakt der Zellen erfordert, kann man vorhersagen, dass während der Zellaggregation die C-Signalaktivität, der eine einzelne Zelle ausgesetzt ist, zunimmt (Abb. 2, Regelkreis 2). In einem zweiten Regelkreis führt die C-Signalübertragung zu einer verstärkten Transkription des csgA-Gens, was wiederum zur Akkumulation von p25 und damit zur Bildung von p17 führt. Dies wiederum erhöht die Häufigkeit der Übertragung des C-Signals auf eine benachbarten Zelle (Abb. 2, Regelkreis 1). Zellen, die an der C-Signalübertragung beteiligt sind, werden somit einer stetig steigenden Signalaktivität ausgesetzt. Dies ist der Vorteil zweier, das Signal verstärkender Regelkreise.

Es gibt drei unabhängige Belege, die zeigen, dass die kontrollierte Zunahme an C-Signalaktivität, welcher Zellen im Entwicklungszyklus ausgesetzt sind, eine Schlüsselrolle bei der Koordinierung von Aggregation, Sporulation und Genexpression durch das C-Signal spielt. Kim und Kaiser [2] gaben verschiedene Mengen des gereinigten C-Signals zu hungernden csgA^--Zellen und beobachteten, dass Aggregation und frühe C-signalabhängige Genexpression durch mittlere C-Signalaktivitäten induziert wurden, während Sporulation und späte C-signalabhängige Genexpression erst bei hohen C-Signalaktivitäten ausgelöst wurden. Durch die In-vivo-Manipulation der Expression des csgA-Gens machten Li et al. [5] ähnliche Beobachtungen. Schließlich konnten Kruse et al. [3] durch eine systematische Veränderung der Akkumulation des C-Signals in vivo zeigen, dass eine Erhöhung der C-Signalaktivität früh im Entwicklungszyklus zu einer frühen Aggregation, Sporulation und Expression C-signalabhängiger Gene führt. Es wurde weiterhin beobachtet, dass die Überproduktion des C-Signals zu einer Entkopplung von Aggregation und Sporulation führte und Sporen auch außerhalb der Fruchtkörper gebildet wurden. Zusammen deuten diese Daten darauf hin, dass das C-Signal die Zellaggregation und die Sporulation bei unterschiedlichen Schwellenwerten induziert. Aggregation und die Expression der frühen Gene werden durch mittlere C-Signalaktivitäten induziert, während Sporulation und die Expression der späten Gene durch hohe C-Signalaktivitäten induziert werden.

Diese Ergebnisse führten zu einem Modell [9], in dem die korrekte zeitliche Abfolge von Aggregation und Sporulation sich direkt aus den C-Signalschwellenwerten in Kombination mit der kontrollierten Zunahme der C-Signalaktivität ergibt. Nach diesem Modell fungiert das C-Signal als Morphogen und bestimmt die zeitliche Abfolge der Entwicklung. Die räumliche Koordination von Aggregation und Sporulation ist höchstwahrscheinlich eine direkte Folge des kontaktabhängigen Mechanismus der C-Signalübertragung [9]. Dieser Mechanismus stellt sicher, dass die C-Signalaktivität, der eine Zelle ausgesetzt ist, die Zelldichte und damit auch die Position der einzelnen Zelle reflektiert. Die hohe C-Signalaktivität, die zur Sporulation führt, wird nur in Zellen erreicht, die dicht gepackt im Inneren des entstehenden Fruchtkörpers liegen. Aus diesem Grund können nur diese Zellen sporulieren. Somit kann eine Zelle mithilfe des C-Signals ihre Position relativ zu anderen Zellen entschlüsseln und die Genexpression und Sporulation entsprechend ihrer Position anpassen.

Signalintegration während der Fruchtkörpermorphogenese

Die Bildung der mit Sporen gefüllten Fruchtkörper ist eine effektive Überlebensstrategie als Reaktion auf einen Hungerzustand. Da jedoch letztendlich nur etwa 10-20 % der Zellen zu Sporen differenzieren, ist die Fruchtkörperbildung ein kostspieliger Prozess. Die durch den Hungerzustand hervorgerufene stringente Kontrolle und das A-Signal-System stellen zwei Kontrollpunkte dar, die sicherstellen, dass die Zellen den Weg der Fruchtkörperbildung nur einschlagen, wenn der Hungerzustand wirklich schwerwiegend ist. Das C-Signal tritt erst in Aktion, wenn die Zellen die oben genannten Kontrollpunkte erfolgreich passiert haben. Wie vorherzusehen war, zeigt sich immer deutlicher, dass Fruchtkörperbildung einer intensiven negativen Kontrolle unterliegt. Die spezifischen Parameter, die von diesem Kontrollsystem detektiert werden, sind noch unbekannt. Die Vielzahl an negativen Regulatoren, die die Fruchtkörperbildung kontrollieren, deutet jedoch darauf hin, dass die Zellen die Bedingungen, denen sie ausgesetzt sind, ständig überwachen, um zu beurteilen, ob der Prozess der Fruchtkörperbildung weitergeführt werden soll oder nicht. Ein regulatorischer Schaltkreis, der die Integration von positiv als auch negativ wirkenden Signalwegen beinhaltet, ist äußerst robust und stattet das System mit der Fähigkeit aus, die Fruchtkörperbildung fortzuführen oder abzubrechen, je nach den spezifischen Bedingungen, denen die Zellen ausgesetzt sind.

Abschließende Betrachtungen

Die meisten interzellulären Signale, die in Bakterien identifiziert wurden, sind kleine diffusionsfähige Moleküle mit einer Masse M. xanthus nicht der Fall. Bei diesem Signal handelt es sich um ein nicht-diffusionsfähiges, auf der Zelloberfläche lokalisiertes 17 kDa-Protein, das die Zellen in die Fruchtkörpervorläufer führt und ihnen hilft, ihre Position innerhalb einer Anhäufung von Zellen abzuschätzen. Es stellt sich die Frage, warum M. xanthus dieses Zelloberflächen-assoziierte Signalmolekül anstelle eines frei diffusionsfähigen Signalmoleküls verwendet, um die beiden wichtigen morphologischen Ereignisse während der Fruchtkörperbildung zu induzieren. M. xanthus-Zellen sind dem Problem ausgesetzt, dass ihre durchschnittliche Geschwindigkeit nur 2-5 µm/min beträgt. Diese Geschwindigkeit, die nur etwa 50-100fach größer ist als die der Kontinentalbewegung, ist so gering, dass die wegweisenden Signale eines diffusionsfähigen Aggregationssignals verflogen wären, bevor die Zellen sich im Konzentrationsgradienten eines solchen Signals orientieren könnten. Um dieses Problem zu umgehen, hat sich M. xanthus ein Zelloberflächen-assoziiertes Signalmolekül angeeignet. Der Vorteil dieses Signalmoleküls ist, dass es sich mit der gleichen Geschwindigkeit wie die Zellen bewegt. Daher erlaubt es den Zellen, sich zu reorientieren, ohne die Richtungswahrnehmung zu verlieren.